下一代超快激光器减少了非线性细胞成像的障碍

锁模光纤和磁盘激光器加快了非线性显微镜技术对细胞进行高分辨率化学成像的速度。

图1.具有ATTO标记的肌动蛋白和DAPI标记的核的人类干细胞的高分辨率多光子图像。
图1.具有ATTO标记的肌动蛋白和DAPI标记的核的人类干细胞的高分辨率多光子图像。
(由慕尼黑应用科学大学的Thomas Hellerer提供)

活细胞和亚细胞成分的化学和形态分析是生物学的基石。结合这些技术以产生细胞和细胞器的二维和三维化学图像,使人们对细胞功能有了更深入的了解,从而导致了现代生物学和医学的许多突破。在过去的40年中,激光在开发高分辨率化学成像技术(尤其是基于激光的成像技术)中发挥了不可估量的作用。 拉曼荧光光谱。本文简要介绍了激光显微镜的历史,并同时讨论了当时的激光技术如何影响特定技术的优势,重点是超快激光系统。

非线性过程,例如 多光子荧光 相干拉曼显微镜和传统拉曼显微镜相比传统的拉曼和荧光细胞成像具有多种优势。这些技术由于其灵敏度,分辨率以及带有或不带有标签的操作能力而特别有前途。尽管这些技术是30年前首次通过实验证明的,但对超快激光源的需求限制了它们的商业可行性。幸运的是,最近紧凑型锁模光纤和磁盘激光器的繁荣终于使这些技术从物理和工程实验室转移到了生物学和生物化学领域。例如,图1显示了使用TOPTICA Photonics(德国慕尼黑)的FemtoFiber ultra 920测量的干细胞的高分辨率多光子图像。

激光显微镜的历史

双光子荧光光谱, 相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)和激发拉曼光谱(SRS)是多光子荧光和相干拉曼显微镜的特定子集,它们本身是荧光和拉曼光谱的子集。因此,有必要同时看一看它们的发展,以了解整个激光显微镜的发展。 1982年,迈克尔·邓肯(Michael Duncan)等人在海军研究实验室(华盛顿特区,华盛顿)报道了激光显微镜在生物科学中的最早应用,以产生洋葱细胞的CARS图像。1 那时,有必要使用锁模氩离子激光器泵浦的两个染料激光器来提供超快可调谐泵浦(565–620 nm)和斯托克斯(620–700 nm)激发源。

具有讽刺意味的是,直到两年后,才由牛津大学(英国牛津大学)的英格玛·考克斯(Ingemar Cox)建造了第一台能够对活细胞成像的扫描共聚焦荧光显微镜。2 尽管缺乏拉曼显微镜的化学特异性,但使用荧光光谱法极大地简化了激光要求,使Cox能够使用441.6 nm的10 mW HeCd激光对被异硫氰酸荧光素(FITC)染色的仓鼠肾细胞成像。尽管样品制备和潜在的光化学降解,但更简单的激光要求导致共聚焦荧光显微镜在很长一段时间内成为细胞成像的主要方法。

尽管如此,非线性显微镜技术的研究仍在继续,1985年,巴伊兰大学(以色列拉马特甘)的Isaac Freund和Moshe Deutsch发表了第一张生物组织的第二谐波显微镜图像。3 用一个 Q开关Nd:YAG激光,他们产生了尾腱中胶原纤维的图像,显​​示了检测纤维取向和厚度的能力。分辨率相对较粗糙(约50 µm),但是他们的工作显示了为细胞生物学开发无标签化学图像的巨大希望。

五年后,在康奈尔大学(纽约州伊萨卡),Winfried Denk,James Strickler和Watt Webb使用锁模染料激光对活细胞的两光子荧光显微镜图像进行了重要研究,从而将非线性显微镜提高到了一个新的水平。脉冲宽度约为100 fs。4 尽管从一开始就从使用近红外激发源转换为活细胞成像的优势显而易见,但当时的激光源对于大规模采用该技术仍然过于繁琐。尽管自锁模的Ti:蓝宝石激光器在整个1990年代和2000年代初都取代了染料激光器,但它们仍然过于昂贵,庞大,并且对于广泛的商业化而言仍然存在问题。幸运的是,在过去的十年中,随着锁模光纤和磁盘激光器的商业化,超快激光技术有了复兴,大大降低了超快激光源的成本和复杂性。例如,与典型的锁模钛蓝宝石激光器相比,TOPTICA Photonics FemtoFiber ultra 920的激光头(见图2)尺寸仅为77×165×300 mm,重量为4 kg。大于40倍。图2. TOPTICA Photonics的FemtoFiber ultra 920(仅激光头)。图2. TOPTICA Photonics的FemtoFiber ultra 920(仅激光头)。(由TOPTICA Photonics提供)

有趣的是,在同一年首次证明了双光子显微镜技术的同时,Gerwin Pupples和来自特温特大学(荷兰恩斯赫德)和马克斯普朗克研究所(德国哥廷根)的联合研究人员共同开发了第一台能够对单个活细胞成像的共聚焦拉曼显微镜。5 共焦拉曼光谱仪具有出色的空间分辨率(小于1 µm)3)和优异的化学特异性。不幸的是,共焦拉曼灵敏度低,因为它依赖于自发拉曼散射。尽管最初有希望,但要花15年时间才能为最初为电信开发的激光和检测器技术使共焦拉曼与共焦荧光竞争。

非线性显微镜激光器的当前状态

与钛蓝宝石不同,钛蓝宝石可在大约700至900 nm之间高度可调,峰值效率在780 nm附近,大多数锁模光纤和盘状激光器在900-1100 nm范围内工作。该光谱范围与生物学家感兴趣的大多数荧光蛋白的双光子吸收带很好地对应。近红外激发波长还具有高深度穿透性和低光毒性的优点,使其非常适合对活组织成像。来自苏黎世大学(瑞士苏黎世)的Fabian Voigt和合作者是最早证明更长波长激发的优势的人之一。他们开发了1027 nm被动锁模二极管泵浦的半导体圆盘激光器,该激光器在2017年初显示出与Ti:蓝宝石激光器相当的多光子成像性能。6 锁模光纤和磁盘激光器的缺点之一是它们在单个输出波长下工作。但是,如今,现成的现成解决方案就像来自Applied Physics&Electronics(德国柏林)的picoEMERALD S一起提供,带有内置光学参量振荡器(OPO)。

Liam Wilson,William Tipping等人在斯特拉斯克莱德大学(苏格兰格拉斯哥)的研究人员于今年早些时候发表了一个最新例子,当时他们使用SRS绘制了基于炔烃的报告分子在细胞内pH感测中的细胞质分布。7 图3显示了用报道分子处理过的前列腺癌细胞的高分辨率SRS图像。绿色图像代表CH的强度分布3 伸展(2933厘米-1)(表示蛋白质浓度),红色表示CH2 伸展(2851厘米-1)对应于脂质浓度,青色表示炔烃带(2221 cm-1)的pH报道分子证明了探测细胞内pH的能力。使用双输出picoEMERALD产生1031.4 nm的斯托克斯光束和700至900 nm的可调泵浦光束,脉冲宽度为2 ps,用于记录所有三个SRS图像。图3.用开发用于细胞pH传感的基于炔烃的报告分子处理的人前列腺癌细胞的高分辨率SRS图像。7绿色表示2933 cm-1(a)的SRS强度,2851 cm-1的红色表示- 1(b),以及在2221 cm-1(c)处的青色。图3.用开发用于细胞pH传感的基于炔烃的报告分子处理的人前列腺癌细胞的高分辨率SRS图像。7绿色表示2933 cm-1(a)的SRS强度,2851 cm-1的红色表示- 1(b),以及在2221 cm-1(c)处的青色。(经作者许可转载)

超快激光器调谐的另一种新兴方法是孤子自频移(SSFS),它可以实现全光纤可调谐激光器。自1980年代中期以来,光纤中SSFS的理论已经建立,8 SSFS的商业实施才刚刚开始。去年夏天,作为TOPTICA项目(德国Graefelfing)和OFS实验室(新泽西州萨默塞特)共同努力的一部分,开发了一种全光纤可调锁模激光器,其脉冲能量高达18 nJ,脉冲频率为120 fs宽度,可在1620至1990 nm之间可调。9 在同一篇文章中,来自慕尼黑应用科学大学(德国慕尼黑)的Thomas Hellerer使用此激光器(与外部SHG和OPO结合使用)生成了小鼠脂肪组织的超高分辨率CARS图像和的两光子图像。单个小鼠成纤维细胞被各种荧光团染色。

展望未来

根据Mordor Intelligence的最新市场分析,截至2019年,超快激光市场的总价值达到惊人的14.4亿美元,并且预计未来五年的复合年增长率(CAGR)为12.7%。10 另一家市场分析公司Fact.MR预测,即使在COVID-19爆发后,复合年均增长率仍将达到14%,该公司表示,到2019年,生物成像将占据超快激光器整体市场的30%。11 但是,应该指出的是事实。MR确实预测总体市值会略小。

预计在未来几年内,所有的资金和资源都将投入到超快激光器的开发中,很明显,紧凑,用户友好,低成本系统的趋势只会加速,从而导致非线性技术的日益普及生物和生物医学领域的激光显微镜,尤其是相干拉曼和多光子荧光显微镜。

参考资料

1. M. D. Duncan,J。Reintjes和T.J. Manuccia, 选择。来吧,7,8,350–352(1982)。

2. I. J. Cox, J.Microsc。,133,2,149-154(1984)。

3. I. Freund和M. Deutsch, 选择。来吧,11,2,94-96(1986)。

4. W. Denk,J。H. Strickler和W. W. Webb, 科学,248,4951,73-76(1990)。

5. G. J. Puppels等, 性质,347,6290,301-303(1990)。

6. F. F. Voigt等, 生物医学。选择。表现,8,7,3213–3231(2017)。

7. L. T. Wilson等, 分析员,145,15,5289-5298(2020)。

8. J. P. Gordon, 选择。来吧,11,10,662–664(1986)。

9. A. Zach等, 选择。来吧,44,21,5218–5221(2019)。

10.请参阅 //bit.ly/MordorInt.

11.看 //bit.ly/FactMr.

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