优化从光源到样品平面的固态照明

当来自光引擎的光子在流向显微镜的样本平面的途中迷路时,请按照以下路径查找故障点。

固态光引擎与倒置荧光显微镜的耦合。地点1–黄色标记的5对应于表中报告的用于通量测量的光路中的点。绿线表示从准直适配器输入到样品平面的光路方向。
固态光引擎与倒置荧光显微镜的耦合。地点1–黄色标记的5对应于表中报告的用于通量测量的光路中的点。绿线表示从准直适配器输入到样品平面的光路方向。

茉莉·夏菲,伊恩·约翰逊和克劳迪娅·贾菲

越来越多的具有固态技术阵列的精密光引擎被用于荧光显微镜。这些光源的设计克服了汞灯和金属卤化物弧光灯的显着局限性,可实现令人印象深刻的性能,远远超过了早期的照明选项。固态光引擎可为荧光显微镜应用提供高信噪比(SNR)和分辨率,低检测限以及增强的灵敏度和稳定性,以及高质量的数据,使用寿命长且节省成本。

但是,要实现该性能的价值,照明器的输出必须传播到显微镜的样品平面。1,2 对将光引擎连接到显微镜样品平面的光路进行分析,不仅为优化仪器性能提供了框架,而且为解决照明问题提供了框架。  

通往真相的道路

当发现样品平面的荧光激发不足时,将问题归因于光源似乎是适当的(并且很常见)。但是,这种归因通常是不合适的,因为实际上,沿路径的所有中间组件都可能受到牵连。实际解决这个问题需要仔细考虑所有将照明器输出传输到显微镜的光学组件的贡献(见图),从而影响整个系统的吞吐量。

该表对从固态光引擎到显微镜样品平面的光通量进行了逐步分析。使用10倍物镜(位置5A)在样品平面上测得的通量对应于15–50 mW / mm的辐照度水平2,其范围在宽视野荧光显微镜(1–100 mW / mm2)。2012 Lfw Joh T

对于荧光显微镜应用,产生一定量荧光发射所需的辐照度在所有波长下都不相同。这是因为荧光发射强度取决于可用于荧光团吸收的光子数,对于恒定的辐照度水平,光子数随波长增加。因此,以375 nm激发光产生一定荧光强度水平所需的辐照度是750 nm(2×375 nm)所需的辐照度的两倍,以至于其他因素保持不变。因此,红色光谱区域中较低的辐射通量水平(635/22 nm;请参阅表的最右列),其危害要小于荧光显微镜中的辐射通量水平。

尽管表中所示的辐射通量水平对于常规的宽视野荧光显微镜来说绰绰有余,但确实存在改进的机会。此类改进针对两个主要应用程序需求。首先,要在较短的时间间隔内获取更多图像而又不影响SNR特性,则需要来自光源的较高辐射通量和较短的相机曝光时间。其次,许多用于提高宽视野荧光显微镜的空间分辨率的技术涉及对照明进行空间滤波。由空间滤波引起的损耗必须通过增加光源的输出或改善其与显微镜的耦合或两者来补偿。 

变得更好

作为说明性练习,我们参考表中确定的光路阶段,简要地研究实现这些改进的一些方法。

轻型引擎。 与本示例中使用的SPECTRA X光引擎中包含的非相干光源相反,通过使用固态二极管激光光源,可以提高输出功率(特别是在辐照度方面)。

液体光导。 液体光导在光引擎与显微镜的振动隔离方面提供了好处。它还可以使光源位于远离显微镜附近经常拥挤的空间的远处。但是,这些好处可以以光引擎输出的35%到50%的成本为代价-尽管使用足够强大的光引擎,这些损失的重要性可能会得到改善。并且,尽管具有较大直径(例如5mm而不是3mm)的液体光导传递了辐射通量的显着增加,但是这通常需要对显微镜光路进行重新设计以将增加的传播传播到样品平面。

准直适配器。 装有蝇眼镜的准直仪3 与基于消色差透镜的传统设计相比,具有更高的光通量和空间均匀性。

目的。 在落射荧光显微镜中,检测到的荧光强度与物镜数值孔径(NA)的四次方成比例。因此,优选的目的是具有最大数值孔径的目的,其提供足够的工作距离。

荧光显微镜的照明发生了范式转变。传统的弧光灯有很多局限性,包括它们含有有毒的汞蒸气的事实。另一方面,传统的LED不能满足光功率要求。固态光引擎解决了这些问题,当发现光线不足是另一个问题时,可以将其视为可能的候选者。但是,按照上面介绍的分析步骤进行操作,将有助于显微学家了解照明器与显微镜耦合的细节,并有信心找到此类问题的真正根源。希望它还将协助研究人员最大程度地利用现代固态光引擎提供的性能。

参考资料

1. D.Grünwald,S.M。Shenoy,S。Burke和R.H. Singer, 纳特协议。,3,1809–1814(2008)。

2. D. Dormann, 一号,14,e0214659(2019)。

3. B. Van Giel,Y。Meuret和H. Thienpont, 选择。 。,46,043001(2007)。

贾斯敏·谢弗(Jasmin Schaefer) 是技术支持专家, 伊恩·约翰逊博士是技术支持总监, 克劳迪娅·贾菲(Claudia Jaffe)博士是联合创始人& Executive Vice President of Business Development, all at Lumencor, Beaverton, OR; e-mail: iain.johnson@lumencor.comlumencor.com

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